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  • 공학,기술계열

  • [크로마토그래피] chromatography 정제 순서

  • 크로마토그래피.hwp
  • 등록인 lbh313
  • 등록/수정일 09.07.22 / 09.10.05
  • 문서분량 4 페이지
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보고서설명
◆ chromatography 정제 순서 입니다.
그림과 정제순서를 잘 나타내고있으며 교수님께 칭찬받은 레포트입니다.
본문일부/목차
목차
◆ chromatography 정제 순서
1) Affinity chromatography
2) Ion exchange chromatography
3) 농축
4) Gel chromatography


◈ 정제순서
Affinity chromatography ⇒ SDS-PAGE확인 ⇒ Ion exchange chromatography ⇒ SDS-PAGE확인 ⇒ 농축 ⇒ Gel chramatography ⇒ SDS-PAGE확인 ⇒ final 농축

◆ chromatography 정제 순서
1) Affinity chromatography ; 다른 chromatography에 비해 높은 정제효율과 회수율을 가지고 단 한번에 많은 양의 시료 처리가 가능


① 50mM Tris-HCl(pH7.5) 200mM NaCl이나 PBS buffer로 column의 불순물을 씻겨내고, UV MONITOR에 의해 나타나는 그래프가 평형(일직선으로 감)이 되게 한다
② recorder에 평형이 맞추어지면, buffer에 있던 노즐을 파쇄하여 얻은 상등액(sup.)이 든 tube에 넣고 sup을 column에 흘려보낸다.
③ column에 있던 buffer의 색깔이 노랗게 되며(sup. 때문) 이 sup.은 UV Monitor를 지나면서 UV에 의해 단백질의 용출(elution)을 측정된다.
④ 측정된 단백질이 든 sup.은 monitor의 다른 부분에서 빠져나가며 이 것을 recorder의 그래프의 peak를 보고 collection한다.
⑤ 각각의 받은 sup.을 fraction이라 하며 fraction을 받은 tube에는 라벨링을 필수 적으로 해준다.
※ recorder의 peak의 해석방법
ㄱ. 단백질 정량
ㄴ. 전기영동
ㄷ. 생물활성의 측정
ㄹ. 면역학적 동종
ㅁ. 아미노산 조성분석
ㅂ. 아미노산 배열 결정

⑥ sup.의 종류
- unbound ; column내의 ligand와 친화력이 없는 찌꺼기나 불순물(상등액+평형잡았던 buffer)
- 20mM Imidazole을 넣어 column내의 ligand와 붙어 있는 단백질 부분을 용출(elusion)한다. ; sup의 친화력이 20mM 주입시 낮다면 fraction으로 떨어져 나올수 있음
- 이런 식으로 50mM, 100mM, 200mM로 농도를 점점 올려서 ligand에 binding하고 있는 단백질을 모두 거둬낸다.
⑦ column에 남은 찌꺼기에 의한 미생물 번식을 방지하고자 30%으로 희석한 에탄올을 넣는다.(waxhing 작업은 먼저 평형시 썼던 buffer로 다시 평형을 맞추고 그 뒤, 알코올을 채운다)
⑧ SDS-PAGE에 의한 fraction의 찾으려는 단백질의 확인은 NCBI나 Expasy에서 그 단백질의 무게를 확인한뒤 마커와 fraction이 나온 band의 위치를 비교하면서 확인
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